Enzýmy sú pozoruhodné molekulové prístroje, ktoré znižujú aktivačnú energiu potrebnú na odštartovanie chemickej reakcie.
Tieto biokatalyzátory sú priestorovo usporiadané tak - aby sa určité bočné reťazce aminokyselín dostali do vzájomnej blízkosti aby vytvorili tzv. aktívne miesto enzýmu. Na toto miesto sa potom viažu molekuly látky, ktorá s enzýmom reaguje. Táto látka, nazývaná ako substrát, sa za po naviazaní na enzým dostáva (za pomoci rôznych inter-molekulových síl) do optimálnej vzdialenosti a orientácie, aby sa tak umožnila prestavba chemických väzieb. Tento prechodný stabilizovaný stav určí, ktorá chemická reakcia prebehne.
Akonáhle je substrát chemicky zmenený na produkt, stráca schopnosť väzby na enzým, uvoľňuje sa, aktívne miesto na enzýme sa vracia do pôvodného stavu a je pripravené na ďalší substrát.
Enzýmy urýchľujú reakcie mnohonásobne. A bez ich prítomnosti by väčšina reakcii v organizme nemohla prebiehať, respektívne by prebiehala veľmi pomaly. Dokonca aj taká jednoduchá reakcia, akou je hydratácia oxidu uhličitého, je katalyzovaná enzýmom karboanhydrázou. Prenos CO2 z tkanív do krvi a následne do alveolárneho vzduchu by bol menej efektívny bez prítomnosti tohto enzýmu. V skutočnosti, karboanhydráza je jedným z najrýchlejších enzýmov, ktoré poznáme. Každá molekula enzýmu hydratuje 105 molekúl CO2 za sekundu. Pričom katalyzovaná rýchlosť je 107-krát rýchlejšia ako nekatalyzovaná.
Čo je dôležité vedieť pre stanovenie aktivity, je to, že enzýmy sú vysoko špecializované. Väčšinou katalyzujú len jeden, alebo viacero podobných substrátov - pri jednom type chemickej reakcii (alebo pri niekoľko veľmi podobných typoch reakcii).
Enzýmy sú v biologickom materiáli prítomné vo veľmi nízkych koncentráciách. Preto sa ich množstvo meria nepriamo na základe rýchlosti akou sú schopné katalyzovať premenu substrátu na produkt vo zvolenom časovom intervale. Táto metóda je dostatočne citlivá a presná, pokiaľ je pre stanovenie zvolený špecifický substrát, ktorý enzým katalyzuje, a pokiaľ je zvolená vhodná metóda stanovenia premeny substrátu na produkt.
Napríklad na stanovenie aktivity AST sa používa ako substrát kyselina asparágová. Tá je enzýmom počas reakcie pretvorená na oxalacetát - ktorý je v ďalšej reakcii účinkom enzýmu malátdehydrogenázy redukovaný na malát - za súčasnej oxidácie NADH na NAD+. Aktivitu AST stanovíme kineticky na základe rýchlosti úbytku NADH v priebehu reakcie. Katalytická koncentrácia AST je tak úmerná poklesu absorbancie.
V reakčnej zmesi pre stanovenie AST je okrem substrátu prítomný aj pyridoxal-5-fosfát a laktátdehydrogenáza. Prídavok pyridoxal-5-fosfátu zabezpečuje dostatočnú saturáciu AST a tým zaisťuje plnú aktivitu enzýmu. Prítomnosť laktátdehydrogenázy je dôležitá pre to, aby sa zaistila redukcia endogénneho pyruvátu, ktorý je prítomný vo vzorke séra a ktorý taktiež spotrebováva NADH. Touto reakciou sa zabraňuje získaniu falošných výsledkov.
Tieto reakcie prebiehajú počas 5 minútovej predinkubácie séra. Po predinkubácii sa reakcia štartuje pridaním 2-oxoglutarátu. Aktivita enzýmu je potom monitorovaná odčítaním absorbancie v minútových intervaloch po dobu niekoľkých minút.
Za podmienky že enzým pracuje v prostredí so značným nadbytkom substrátu, môžeme kineticky vyjadriť množstvo enzýmu ako rýchlosť premeny substrátu. Jednotka množstva enzýmu, alebo správnejšie - množstvo enzýmovej aktivity - slúži “katal”. Jednotka “katal” vyjadruje také množstvo enzýmovej aktivity, ktorá katalyzuje premenu 1 molu substrátu za sekundu. Pre prax je ale táto jednotka príliš veľká, preto sa väčšinou pracuje s “mikro-katalom” alebo “nano-katalom”.
V porovnaní s anorganickými katalyzátormi sú enzýmy omnoho účinnejšie, ale aj citlivejšie na vonkajšie vplyvy, od ktorých závisí rýchlosť reakcie. Je to pomer koncentrácie substrátu a produktu, teplota, pH reakčného prostredia a prítomnosť aktivátorov a inhibítorov.
Pre reakciu je dôležitá koncentrácia substrátu a aj enzýmu. Je jasné, že pokiaľ sa v reakčnej zmesi nachádza málo enzýmu, reakcia bude prebiehať pomalšie - a to nie z dôvodu nízkej enzýmovej rýchlosti. V prípade, že je koncentrácia enzýmu dostatočne vysoká, rýchlosť enzýmovej reakcie bude priamo úmerná koncentrácii substrátu. Ale len dovtedy, kým nebude obsadená väčšina aktívnych miest enzýmu, teda kým koncentrácia substrátu na enzýme nedosiahne saturačný bod. Ďalšie zvyšovanie koncentrácie substrátu už rýchlosť reakcie neovplyvní, pretože enzým už ďalšie aktívne miesto nemá (čo znamená, že dosiahol svoju maximálnu rýchlosť). Na druhú stranu zvyšovanie koncentrácie produktu v reakčnej zmesi zhoršuje prístup substrátu k aktívnemu enzýmu čím sa celá reakcia spomaľuje. A pri presiahnutí určitej koncentrácie sa reakčná zmes produktom presýti do bodu, kedy už ďalšia reakcia nie je možná.
Jedným z ďalších faktorov, ktorý ovplyvňuje aktivitu enzýmu je teplota. So zvyšovaním teploty sa zvyšuje aktivita enzýmov približne dvojnásobne, v rozmedzí od 20 do 50 °C. Pri vyšších teplotách sa rýchlosť reakcie už znižuje, pretože sa bielkovinové časti enzýmu denaturujú. (Až na výnimky, ako sú npr enzýmy termostabilných baktérii.) Teplota pri ktorej enzým vykazuje maximálnu aktivitu sa nazýva teplotné optimum. Pre väčšinu je to rozmedzie od 35 do 45 °C. Pri teplote okolo bodu mrazu reakcie takmer neprebiehajú. Preto sa k uchovávaniu biologického materiálu využíva teplota mínus 20 °C, kedy sa enzýmové reakcie úplne zastavujú.
Ďalším faktorom, ktorý výrazne ovplyvňuje aktivitu enzýmu je hodnota pH prostredia. Použitie silne kyslých alebo silne alkalických roztokov môže zapríčiniť až denaturáciu enzýmu. Menej drastické zmeny pH prostredia ovplyvňujú aktivitu zmenou stupňa disociácie funkčných skupín enzýmu a substrátu, prípadne zmenou priestorového usporiadania molekuly enzýmu, čo zmení schopnosť substrátu viazať sa s enzýmom. Väčšina enzýmov vykazuje maximálnu aktivitu v rozmedzí hodnôt pH od 5 do 8. Táto oblasť sa nazýva pH optimum. Pochopiteľne existujú aj výnimky. Niektoré enzýmy majú pH optimum pri značne odlišných hodnotách, npr. pre pepsín je to pH 2 alebo pre alkalickú fosfatázu pH 9.
Katalytickú aktivitu enzýmu taktiež ovplyvňuje aj zmena iónovej sily roztoku, zloženie pufru, oxidoredukčné podmienky, ionizujúce žiarenie alebo prídavok aktivátorov či inhibítorov v reakčnej zmesi.
V prípade použitia inhibítorov sa molekuly enzýmu inaktivujú dočasne alebo trvalo. Inhibítor sa buď naviaže na regulačné miesto na molekule enzýmu, ktorého naviazanie spôsobí štrukturálne zmeny a enzým sa inaktivuje. Alebo inhibítor obsadí miesto kde sa naväzuje substrát, čím enzým znefunkční. Čo sa týka aktivátorov, tak tie enzýmy aktivujú naviazaním sa na molekulu enzýmu čím celú reakciu spustia, alebo substrát upravia spôsobom aby reakcia prebehla rýchlejšie.
Akonáhle je substrát chemicky zmenený na produkt, stráca schopnosť väzby na enzým, uvoľňuje sa, aktívne miesto na enzýme sa vracia do pôvodného stavu a je pripravené na ďalší substrát.
Enzýmy urýchľujú reakcie mnohonásobne. A bez ich prítomnosti by väčšina reakcii v organizme nemohla prebiehať, respektívne by prebiehala veľmi pomaly. Dokonca aj taká jednoduchá reakcia, akou je hydratácia oxidu uhličitého, je katalyzovaná enzýmom karboanhydrázou. Prenos CO2 z tkanív do krvi a následne do alveolárneho vzduchu by bol menej efektívny bez prítomnosti tohto enzýmu. V skutočnosti, karboanhydráza je jedným z najrýchlejších enzýmov, ktoré poznáme. Každá molekula enzýmu hydratuje 105 molekúl CO2 za sekundu. Pričom katalyzovaná rýchlosť je 107-krát rýchlejšia ako nekatalyzovaná.
Čo je dôležité vedieť pre stanovenie aktivity, je to, že enzýmy sú vysoko špecializované. Väčšinou katalyzujú len jeden, alebo viacero podobných substrátov - pri jednom type chemickej reakcii (alebo pri niekoľko veľmi podobných typoch reakcii).
Stanovenie enzýmovej aktivity
Enzýmy sú v biologickom materiáli prítomné vo veľmi nízkych koncentráciách. Preto sa ich množstvo meria nepriamo na základe rýchlosti akou sú schopné katalyzovať premenu substrátu na produkt vo zvolenom časovom intervale. Táto metóda je dostatočne citlivá a presná, pokiaľ je pre stanovenie zvolený špecifický substrát, ktorý enzým katalyzuje, a pokiaľ je zvolená vhodná metóda stanovenia premeny substrátu na produkt.
Napríklad na stanovenie aktivity AST sa používa ako substrát kyselina asparágová. Tá je enzýmom počas reakcie pretvorená na oxalacetát - ktorý je v ďalšej reakcii účinkom enzýmu malátdehydrogenázy redukovaný na malát - za súčasnej oxidácie NADH na NAD+. Aktivitu AST stanovíme kineticky na základe rýchlosti úbytku NADH v priebehu reakcie. Katalytická koncentrácia AST je tak úmerná poklesu absorbancie.
V reakčnej zmesi pre stanovenie AST je okrem substrátu prítomný aj pyridoxal-5-fosfát a laktátdehydrogenáza. Prídavok pyridoxal-5-fosfátu zabezpečuje dostatočnú saturáciu AST a tým zaisťuje plnú aktivitu enzýmu. Prítomnosť laktátdehydrogenázy je dôležitá pre to, aby sa zaistila redukcia endogénneho pyruvátu, ktorý je prítomný vo vzorke séra a ktorý taktiež spotrebováva NADH. Touto reakciou sa zabraňuje získaniu falošných výsledkov.
Tieto reakcie prebiehajú počas 5 minútovej predinkubácie séra. Po predinkubácii sa reakcia štartuje pridaním 2-oxoglutarátu. Aktivita enzýmu je potom monitorovaná odčítaním absorbancie v minútových intervaloch po dobu niekoľkých minút.
Za podmienky že enzým pracuje v prostredí so značným nadbytkom substrátu, môžeme kineticky vyjadriť množstvo enzýmu ako rýchlosť premeny substrátu. Jednotka množstva enzýmu, alebo správnejšie - množstvo enzýmovej aktivity - slúži “katal”. Jednotka “katal” vyjadruje také množstvo enzýmovej aktivity, ktorá katalyzuje premenu 1 molu substrátu za sekundu. Pre prax je ale táto jednotka príliš veľká, preto sa väčšinou pracuje s “mikro-katalom” alebo “nano-katalom”.
Faktory ovplyvňujúce rýchlosť enzýmovej reakcie
V porovnaní s anorganickými katalyzátormi sú enzýmy omnoho účinnejšie, ale aj citlivejšie na vonkajšie vplyvy, od ktorých závisí rýchlosť reakcie. Je to pomer koncentrácie substrátu a produktu, teplota, pH reakčného prostredia a prítomnosť aktivátorov a inhibítorov.
Pre reakciu je dôležitá koncentrácia substrátu a aj enzýmu. Je jasné, že pokiaľ sa v reakčnej zmesi nachádza málo enzýmu, reakcia bude prebiehať pomalšie - a to nie z dôvodu nízkej enzýmovej rýchlosti. V prípade, že je koncentrácia enzýmu dostatočne vysoká, rýchlosť enzýmovej reakcie bude priamo úmerná koncentrácii substrátu. Ale len dovtedy, kým nebude obsadená väčšina aktívnych miest enzýmu, teda kým koncentrácia substrátu na enzýme nedosiahne saturačný bod. Ďalšie zvyšovanie koncentrácie substrátu už rýchlosť reakcie neovplyvní, pretože enzým už ďalšie aktívne miesto nemá (čo znamená, že dosiahol svoju maximálnu rýchlosť). Na druhú stranu zvyšovanie koncentrácie produktu v reakčnej zmesi zhoršuje prístup substrátu k aktívnemu enzýmu čím sa celá reakcia spomaľuje. A pri presiahnutí určitej koncentrácie sa reakčná zmes produktom presýti do bodu, kedy už ďalšia reakcia nie je možná.
Jedným z ďalších faktorov, ktorý ovplyvňuje aktivitu enzýmu je teplota. So zvyšovaním teploty sa zvyšuje aktivita enzýmov približne dvojnásobne, v rozmedzí od 20 do 50 °C. Pri vyšších teplotách sa rýchlosť reakcie už znižuje, pretože sa bielkovinové časti enzýmu denaturujú. (Až na výnimky, ako sú npr enzýmy termostabilných baktérii.) Teplota pri ktorej enzým vykazuje maximálnu aktivitu sa nazýva teplotné optimum. Pre väčšinu je to rozmedzie od 35 do 45 °C. Pri teplote okolo bodu mrazu reakcie takmer neprebiehajú. Preto sa k uchovávaniu biologického materiálu využíva teplota mínus 20 °C, kedy sa enzýmové reakcie úplne zastavujú.
Ďalším faktorom, ktorý výrazne ovplyvňuje aktivitu enzýmu je hodnota pH prostredia. Použitie silne kyslých alebo silne alkalických roztokov môže zapríčiniť až denaturáciu enzýmu. Menej drastické zmeny pH prostredia ovplyvňujú aktivitu zmenou stupňa disociácie funkčných skupín enzýmu a substrátu, prípadne zmenou priestorového usporiadania molekuly enzýmu, čo zmení schopnosť substrátu viazať sa s enzýmom. Väčšina enzýmov vykazuje maximálnu aktivitu v rozmedzí hodnôt pH od 5 do 8. Táto oblasť sa nazýva pH optimum. Pochopiteľne existujú aj výnimky. Niektoré enzýmy majú pH optimum pri značne odlišných hodnotách, npr. pre pepsín je to pH 2 alebo pre alkalickú fosfatázu pH 9.
Katalytickú aktivitu enzýmu taktiež ovplyvňuje aj zmena iónovej sily roztoku, zloženie pufru, oxidoredukčné podmienky, ionizujúce žiarenie alebo prídavok aktivátorov či inhibítorov v reakčnej zmesi.
V prípade použitia inhibítorov sa molekuly enzýmu inaktivujú dočasne alebo trvalo. Inhibítor sa buď naviaže na regulačné miesto na molekule enzýmu, ktorého naviazanie spôsobí štrukturálne zmeny a enzým sa inaktivuje. Alebo inhibítor obsadí miesto kde sa naväzuje substrát, čím enzým znefunkční. Čo sa týka aktivátorov, tak tie enzýmy aktivujú naviazaním sa na molekulu enzýmu čím celú reakciu spustia, alebo substrát upravia spôsobom aby reakcia prebehla rýchlejšie.
Zoznam internetových zdrojov
- Katedra biochémie Univerzita P. J. Šafárika v Košiciach [2007] :
- Sedlák, Danko, Varhač, Paulíková, Podhradský
- Praktikum z biochémie 2. vydanie
- linka
- Ústav chemického a enviromentálneho ižinierstva [2016] :
- Zisťovanie kinetických parametrov katalyzovanej reakcie vo vsádzkovom reaktore
- linka
- Wikiskripta
--- Naspäť na stránku navigácie ---- Naspäť na domovskú stránku ---
0 comments:
Zverejnenie komentára