Táto metóda je založená na vysoko špecifickej reakcii antigénu s protilátkou - na ktorej je naviazaný enzým. V poslednom kroku reakcie enzým katalyzuje chemickú premenu substrátu na farebný produkt. Koncentráciu produktu stanovujeme fotometricky, pričom tá je priamo úmerná farebnej zmene, ktorá sa udiala v reakčnej zmesi.
Ako funguje ELISA
ELISA umožňuje detekciu hľadaného proteínu v kvapalnej vzorke, v reakčnej nádobke kde je ukotvený antigén alebo protilátka. Za pomoci kvapalných činidiel - v riadenej sekvencii imunologických a biochemických reakcii - ktoré na konci tejto sekvencie vygenerujú signál, ktorý je možné zmerať a interpretovať ako mieru množstva hľadaného proteínu vo vzorke.
Detekcia hľadaného proteínu
V laboratórnej praxi sa metóda ELISA využíva k diagnostike infekčných chorôb človeka alebo zvierat. Stanovujú sa buď protilátky proti konkrétnemu patogénu, alebo sa detekujú antigény bakteriálne, vírusové, parazitárne či priónové. Hľadaný proteín možno detekovať v sére, v tkanive a tkanivových tekutinách (npr. Mozgovomiešny mok), stolici či slinách.
Je jasné, že sa v reakcii nemôže použiť materiál vo svojej natívnej forme. V prípade tuhých materiálov je potrebné ich skvapalnenie v procese, ktorý umožňuje uvoľnenie hľadaného proteínu do tekutiny. V prípade priamo tekutých materiálov je to jednoduchšie -- no bez ohľadu na pôvod sa musí vzorka upraviť za pomoci tzv vzorkového pufra, ktorý okrem rozriedenia (aby sa zmenšilo množstvo potrebné pre reakciu s cieľom šetrenia), vzorku pripravuje na reakciu tým, že vysycuje iné protilátky či bielkoviny, ktoré by priebeh reakcie mohli negatívne ovplyvniť. Robí to za pomoci prímesí. Npr v sete ELISA Borrelia IgM, vzorkový pufer obsahuje okrem iného aj IgG/RF absorbent (Ten vysycuje reumatoidný faktor a IgG protilátky. Pretože tie sa prioritne viažu na antigén, ktorý je umiestnený v reakčnej nádobke, čím vyrábajú falošnú pozitivitu.)
V reakčnej nádobke
Reakcia ELISA sa robí v tzv. platničke. Čo sú odlomiteľné mikrotitračné nádobky z polystyrénu, spojené po ôsmich kusoch do jedného riadku, ktorý sa nazýva aj ako “stríp”. Tieto riadky (čiže strípy) sú uložené vedľa seba po dvanástich kusoch v podpornom rámčeku z pevného plastu, ktorý okrem zafixovania celej platničky pre ľahšiu manipuláciu; slúži aj ako nosič (v prípade že sa platnička vloží do premývačky alebo do analyzátora na spracovanie).
Nádobky platničky sú potiahnuté buď antigénovým extraktom patogénneho mikroorganizmu, alebo protilátkou (proti nejakému špecifickému antigénu). Protilátka alebo antigén sú znehybnené v reakčnej nádobke. Zvyčajne je nimi potiahnuté dno nádobky, alebo bočná stena. V tomto prípade sa využívajú dve vlastnosti imunoglobulínov. A to v prvom rade schopnosť viazať sa s povrchom plastov (npr. polystyrén) a v rade druhom schopnosť viazať sa s enzýmom. Toto umožňuje zafixovanie hľadanej bielkoviny, ako aj separáciu látok používaných v reakcii počas kroku ktorý nazývame premývanie.
Za pomoci kvapalných činidiel
Aby reakcia začala, musí sa vzorka (zriedená vzorkovým pufrom) napipetovať do nádobky. V prípade že vzorka obsahuje hľadanú bielkovinu, naviaže sa počas inkubácie na protilátku či antigén, ktorý je zafixovaný na stene nádobky.
Po inkubácii sa pristúpi k premývaniu, kedy sa zriedená vzorka úplne vymyje a spolu s ňou aj všetky látky ktoré by mohli nevhodne reagovať s ďalším činidlami. Premývanie sa vykonáva s tzv premývacím roztokom. Ten môže obsahovať detergenty - odstraňujúce všetky ostatné bielkoviny; blokátory - ktorý blokujú uvoľňovanie hľadanej bielkoviny; a iné aktívne látky umožňujúce lepšie odstránenie ostatných iných biologických látok zo vzorky ako sú npr tuky. Premývanie sa opakuje po každom jednom kroku (v ktorom sa do reakčnej nádobky pridáva činidlo) a to z dôvodu, aby činidlá nereagovali medzi sebou.
Preto musí byť premývací cyklus dôkladný. Pokiaľ sa platnička premýva menej cyklov než je odporúčaný počet výrobcom, alebo sa roztok pridá v menšom množstve poprípade sa nenechá pôsobiť dostatočne dlhú dobu (čo tiež uvádza výrobca) - môže to viesť k nedokonalému odstráneniu bielkovín alebo iných nadbytočných látok pochádzajúcich zo vzorky - čo spôsobí falošne vyššie hodnoty pri meraní. Na druhú stranu musí byť nádobka po premytí dostatočne suchá. Pokiaľ premývací roztok ostane v reagenčnej nádobke (v objeme väčšom ako je 10uL), môže narušiť pôsobenie činidiel z ďalších krokov reakcie. Prípadne môže v poslednom kroku narušiť molekulu substrátu, čo zasa vedie k falošne nižším hodnotám pri meraní.
Keď je reakčná nádobka dôkladne premytá, pristúpi sa k ďalšiemu kroku. A to k napipetovaniu tzv konjugátu. Jedná sa o roztok obsahujúci protilátky, na ktoré bol naviazaný (čiže konjugovaný) enzým. Táto protilátka sa špecificky viaže na hľadanú bielkovinu, pokiaľ sa tá vo vzorke nachádza (v prípade až sa nenachádza, protilátka sa nemá na čo naviazať a v ďalšom premývaní sa odstráni). Čistota a špecifickosť protilátky je kľúčová. Pokiaľ nie je protilátka dostatočne špecifická, môže sa naviazať aj na bielkoviny podobné tej hľadanej. To samozrejme spôsobuje falošne vyššiu pozitivitu a prípadnú skríženú reakciu (v prípade keď chceme dokázať antigény mikroorganizmov ktoré zdieľajú určité množstvo antigénov s inými členmi svojho druhu).
V konjugáte sa používajú protilátky polyklonálne a monoklonálne. Polyklonálne protilátky predstavujú súbor protilátok z rôznych B lymfocytov, ktoré reagujú na väčšie množstvo oblastí umiestnených na molekule daného antigénu (tzv epitop). Na druhú stranu monoklonálne reagujú len s jedným unikátnym epitopom daného antigénu.
Ich využitie prináša svoje výhody aj nevýhody. Polyklonálne sa vyrábajú pomerne rýchlo a lacno pričom sú pomerne stabilné na zmenu v reakčnom prostredí - no môžu mať variabilitu v účinnosti a špecifickosti; polyklonálne protilátky sú presné a účinné, no pomaly sa vyrábajú sú drahé a majú vyššiu senzitivitu na zmenu v reakčnom prostredí.
Protilátky použité v konjugáte volí výrobca danej súpravy, rovnako ako volí aj enzým, ktorý na protilátky naviaže. V metóde ELISA sa používa viacero enzýmov (volané aj ako enzýmové značky) najčastejšie však Alkalická fosfatáza alebo Chrenová peroxidáza. Tieto enzýmy umožňujú detekciu hľadanej bielkoviny, pretože vytvárajú pozorovateľnú zmenu farby v prítomnosti určitých substrátov. V metóde ELISA sa používa viacero substrátov, najčastejšie však TMB (( pre zaujímavosť = 3,3',5,5'-tetramethylbenzidin )).
Pokiaľ sa v predošlých krokoch spojila hľadaná bielkovina s protilátkou, ktorá bola zafixovaná na stene nádobky a pokiaľ sa na tento komplex naviazala protilátka označená enzýmom - v poslednom kroku enzým zreaguje so substrátom, čoho následkom reakčná zmes zmení svoju farbu. Rýchlosť zmeny farby, ako aj jej intenzita závisí od množstva hľadanej bielkoviny vo vzorke (a prípadne od správnosti prevedenia reakcie). Slovo rýchlosť je dôležité - pretože sa reakcia (enzýmu so substrátom) nenechá “dôjsť do konca”, ale sa tzv zastopuje po určitom čase. V prípade TMB je to 15minút a stopuje sa kyselinou sírovou (0.2 mol/l). Kyselina spôsobí zmenu pH zmesi čím reakciu preruší. Zmena pH spôsobí aj zmenu farby ( v prípade TMB z modrej na žltú ).
Vygenerujú signál
Pod pojmom “signál” sa v tomto prípade myslí - zmena v reakčnej zmesi, ktorá sa dá zmerať za pomoci fyzikálnych procesov. V prípade metódy ELISA sa jedná o optickú zmenu reakčnej zmesi, ktorá sa dá zmerať ako absorbancia.
Absorbancia je pohlcovanie svetla o určitej vlnovej dĺžke, atómami alebo molekulami roztoku, cez ktorý toto svetlo prechádza. V prípade modrého produktu TMB sa používa vlnová dĺžka 620 a 650 nm (žltý produkt používa 405 nm). Prístroj za pomoci svojho detektora zachytí svetlo, ktoré roztokom prešlo (lebo zvyšok svetla roztok pohltil). Z absorbancie, ktorú zmeral potom počítač vypočíta koncentráciu hľadanej látky vo vzorke, pričom tento výpočet sa môže líšiť od metodiky k metodike. V praxi sa v metóde ELISA používajú dva typy výpočtu koncentrácie. Za pomoci kalibračnej krivky a za pomoci tzv Cutoff (čítaj kat-of).
Pri súprave využívajúcej kalibračnú krivku sa musia do ELISA platničky napipetovať kalibrátory - čo sú vzorky s presnou koncentráciou bielkoviny, ktorá reaguje s antigénom alebo protilátkou, fixovanou na povrchu reakčnej nádoby. Koncentráciu ako aj množstvo kalibrátorov, potrebných v reakcii určuje výrobca danej súpravy. Môže sa jednať o rad piatich kalibrátorov so stúpajúcou koncentráciou (z ktorých počítač vytvorí kalibračný graf, z ktorého potom odčítava koncentráciu vzoriek.). Hodnota tohto typu výpočtu sa uvádza v univerzálnych jednotkách. Tie hovoria o relatívne presnej koncentrácii hľadanej bielkoviny vo vzorke.
Pri súprave využívajúcej tzv Cutoff sa do ELISA platničky napipetujú kalibračné vzorky (väčšinou jedna fľaštička na dve pozície) o určitej a rovnakej koncentrácii. Na konci reakcie počítač spriemeruje ich absorbancie a výslednú hodnotu použije na určenie koncentrácie hľadanej bielkoviny vo vzorke. A to za pomoci výpočtu, kedy počítač vydelí absorbanciu vzorky hodnotou Cutoff. Výsledok takéhoto výpočtu sa nazýva ratio (čítaj rej-ši-jó). Čo je hodnota, ktorá hovorí o koncentrácii hľadanej bielkoviny v násobkoch kalibrátora. Napríklad - ratio nižšie než 1 znamená, že koncentrácia hľadanej bielkoviny vo vzorke je nižšia než koncentrácia kalibrátora. Ratio vyššie než 1 znamená, že koncentrácia hľadanej bielkoviny vo vzorke je vyššia než koncentrácia kalibrátora (a číslo vyjadruje, že koľko krát tú hodnotu presiahla).
V niektorých ELISA metódach sa ratio využíva len na vyhodnotenie prítomnosti hľadanej bielkoviny. Vtedy sa namiesto čísla používa slovné hodnotenie “pozit / negat“ (a všetky hodnoty blížiace sa ku cutoff ako “hraničné”).
Aby sa zistilo, či reakcia prebehla správne, do platničky sa dávajú aj vzorky so známou koncentráciou, ktoré slúžia ako kontrola kvality. V prípade, že ich absorbancia nedosiahne požadovanú hodnotu, považuje sa reakcia za nesprávne prevedenú a musí sa zopakovať. Kontroly sa používajú preto: lebo pri každej reakcii sa môže meniť prostredie (npr inkubačná teplota); je nutné skontrolovať dôkladnosť premývania či pipetovania; alebo sa používajú z dôvodu, aby sa vychytala nejaká možná chyba analyzátora (pričom používanie kontrolných vzoriek je aj v súlade so zásadami dobrej laboratórnej praxe).
Druhy ELISA
Testy ELISA sa rozdeľujú podľa spôsobu detekcie hľadanej bielkoviny na päť druhov: Priama, Nepriama, Sendvičová a Kompetitívna.
Priama ELISA využíva mechanizmus spájania antigénu alebo protilátky s pevnou fázou (čiže polystyrénovou stenou nádobky). V prvom kroku sa vzorka zriedená vzorkovým pufrom napipetuje do nádobky (ktorá je čistá - čiže tam nie sú naviazané žiadne protilátky alebo antigény) a nechá sa inkubovať. Počas inkubácie sa hľadaná bielkovina zo vzorky (v prípade že sa tam nachádza) spája so stenou nádobky. Vzorka sa vymyje a následne sa pridá proteín, ktorý obsadí zvyšné voľné miesta v nádobke (aby sa protilátka s enzýmom na ne nenaviazala, čím by vznikla falošná pozitivita). V ďalšom kroku (a po ďalšom premytí), sa do nádobky pridá protilátka značená enzýmom, ktorá v poslednom kroku (po následnom premytí) mení substrát na farebný produkt. Reakcia sa zastavuje po presne stanovenom čase (pretože čím viacej protilátok s enzýmom sa naviaže na hľadanú protilátku, tým reakcia prebehne rýchlejšie).
Nepriama ELISA je podobná priamej. S tým rozdielom že s hľadanou bielkovinou v nádobke zreagujú primárne protilátky, na ktoré sa v ďalšom kroku viažu protilátky označené enzýmom.
Pri sendvičovej ELISA metóde sa pred reakciou naviaže na stenu reakčnej nádobky buď špecifická protilátka alebo antigén. Na ne sa počas inkubácie viaže hľadaná bielkovina (až sa nachádza vo vzorke). V ďalších krokoch (ktoré sprevádza premývanie nádobky) sa na vzniknutý komplex viaže ďalšia špecifická protilátka a potom protilátka značená enzýmom.
Kompetitívna ELISA využíva princípu súťaživého viazania. V prvom kroku sa do vzorky zriedenej pufrom pridá protilátka označená enzýmom. Zmes sa napipetuje do reakčnej nádobky, ktorá je potiahnutá špecifickou protilátkou alebo antigénom - ktoré majú schopnosť viazať sa s hľadanou bielkovinou ako aj s označenou protilátkou (pridanou v prvom kroku). Pričom tie dve počas inkubácie medzi sebou súťažia o voľné väzobné miesto. Takže - čím viac sa vo vzorke nachádza hľadanej bielkoviny, tým bude farebná zmena substrátu menšia, pretože hľadaná bielkovina obsadila miesto protilátke značenej enzýmom, ktorý je schopný zmeniť substrát (a tým aj farbu celej reakčnej zmesi). Preto je koncentrácia nepriamoúmerná farebnej zmene.
História ELISA
V minulosti, predtým než vedci vyvinuli metódu ELISA, sa v imunotestoch využívali rádioaktívne značené antigény alebo protilátky. Pri tomto rádio-imunoteste poskytovala rádioaktivita signál, ktorý indikoval či bola hľadaná bielkovina prítomná vo vzorke. Táto metóda bola prvýkrát popísaná vo vedeckej práci v roku 1960 (R.S.Yalow a S.Berson). No, vzhľadom na to, že rádioaktivita predstavuje hrozbu pre zdravie, hľadali vedci bezpečnejšiu alternatívu, ktorá by takto značené antigény alebo protilátky nevyužívala.
Vo vedeckej práci z roku 1966 ( Wide a Jerker Porath ) vedci popísali techniku zafixovania antigénu alebo protilátky k povrchu reakčnej nádoby.
V roku 1971 výskumníci zo Štokholmskej univerzity vo Švédsku (P.Perlmann a E.Engvall) výskumníci z Holandska (A.Schuur a B.Weemen) nezávisle od seba publikovali práce, v ktorých spojili tieto všetky poznatky do metódy na vykonávanie enzýmovo-imunologických metód.
V roku 1975 vytvorili výskumníci (G.Kohler a C.Milstein) prvú generáciu monoklonálnych protilátok (tie, ktoré sa spájajú len s jedným epitopom antigénu (( čiže miestom kde sa viaže protilátka)) ).
Výskum a vylepšovanie metód ELISA pokračuje aj ďalej. A zatiaľ čo tradičné testy ELISA zvyčajne zahŕňajú chromogénne substráty, ktoré produkujú určitý druh pozorovateľnej farebnej zmeny indikujúce prítomnosť hľadanej látky - súčasné moderné techniky podobné testom ELISA využívajú na vytvorenie detekovatelných signálov flourogénne, elektro-chemi-luminiscenčné a kvantito-pozitívne-PCR značenia spojené s protilátkou alebo antigénom.
Z technického hľadiska tieto novšie testy nezapadajú striktne do kategórie ELISA, pretože použité protilátky alebo antigény nie sú “spojené s enzýmom”, ale sú “spojené s niektorými inými ne-enzymatickými látkami”, ktoré sa používajú na vytváranie detekovateľných signálov. Avšak vzhľadom na to, že všeobecné princípy týchto testov sú si veľmi podobné - zoskupujeme ich do rovnakej kategórie ako testy ELISA (a to imunochemické metódy).
Zaujímavosti
1 : V roku 2012 dokázali vedci vytvoriť ultrazvukový test ELISA, na enzymatickom základe, ktorý využíva nanočastice ako chromogén. Tento test dokáže poskytnúť signál - čitateľný voľným okom z detekcie iba attogramu hľadanej látky (trilióntina gramu). Táto metóda vtedy dokázala potvrdiť iba prítomnosť alebo neprítomnosť hľadanej látky, nie jej skutočnú koncentráciu (pričom tento test slúži len na výskumné účely, npr hľadanie života vo vzorkách z Marsu).
2 : Imunologické metódy podľa typu signálu rozdeľujeme na :
- ELISA - v ktorej enzým spôsobí zmenu farby substrátu, pričom tá zmena sa dá zmerať ako absorbancia vo fotometri
- FLISA - v ktorej je protilátka značená floureskujúcou látkou, pričom sa na konci reakcie meria množstvo svetla flourometrom.
- CLIA - v ktorej enzým spôsobí zmenu v substráte. Výsledný produkt začne svetielkovať, pričom sa na konci reakcie zmeria množstvo vyprodukovaného svetla.
- ECLIA - v ktorej enzým vytvorí chemický komplex. Ten začne svetielkovať, keď sa do zmesi privedie elektrické napätie, pričom sa na konci reakcie zmeria množstvo vyprodukovaného svetla.
- RIA - v ktorej je protilátka značená rádio-izotopom, pričom sa na konci reakcie zmeria množstvo rádioaktivity.
3 : Existuje aj tzv Obrátená ELISA, ktorá nepoužíva klasické platničky ale kvapalné médium (v skúmavke). Do nej sa pridajú označené protilátky reagujúce s hľadanou bielkovinou, ktorá s nimi zreaguje pokiaľ sa nachádza vo vzorke. Potom je kvapalné médium nasaté prístrojom a presúva sa časťou, ktorá vychytáva označené protilátky (tie čo sa nenaviazali na hľadanú bielkovinu) a celá reakčná zmes sa potom posiela cez detektor, kde sa laserom “aktivované” značky vytvárajú detekovateľný signál.
Zoznam bibliografických a internetových zdrojov
- WikiSkripta cz - ELISA - Url : https://www.wikiskripta.eu/w/ELISA
- Wikipedia cz - ELISA - Url : https://cs.wikipedia.org/wiki/ELISA
- Wikipedia en - ELISA - Url : https://en.wikipedia.org/wiki/ELISA
- Katedra botaniky a genetiky Fakulta prírodných vied Univerzita Konštantína Filozofa v Nitre - ELISA - Url : http://www.kbg.fpv.ukf.sk/LMB/VLMB/elisa_popis.html
- Jesseniova lekárska fakulta v Martine Univerzita Komenského v Bratislave Nové metódy v imunológii : https://www.jfmed.uniba.sk/fileadmin/jlf/Pracoviska/ustav-mikrobiologie-a-imunologie/mikro_imuno_7_tyzden/imunol_prakticke_cvicenie_8_elisa__wb.pdf
- Iowa State Seed Science Center - Dave Rambow :https://analyzeseeds.com/wp-content/uploads/2016/06/ELISA_Basics_2016_Immuno_WS.pdf
- Euroimmun- Anti Borrelia ELISA
0 comments:
Zverejnenie komentára